标签：fq samtools 双端 s1 测序 gz hisat2

转录组分析在当下研究功能基因组领域十分常用。相关软件组合种类也十分丰富，本文采用了hisat2+samtools+stringtie策略从转录组数据中挖掘差异表达基因。在这里小编整理了一下此套组合的执行流程，以供日后查阅；同时分享在平台，如果能帮助到更多初学者，小编将不甚荣幸，如有谬误也希望各路大佬批评指正。

先从整体上看一下软件们所执行的功能：
hisat2：建立参考基因组索引，reads的比对
samtools：sam2bam的转化
stringtie：估算转录本表达量

所用的数据结构如下，此处用了酵母的转录组数据和参考基因组：
双端测序数据已经经过fastqc过滤，具体过滤流程本文没有涉及。示例数据仅供参考。执行时要关注文件格式转化，以及各种格式下包含的生物信息。

@biocloud:~/1223/NGS2022$ tree
.
├── gene_data.csv//差异表达基因样例，相当于最终输出的标准答案。
├── genome
│   ├── yeast.fa//参考基因组文件
│   ├── yeast.gff//参考基因组注释文件
│   └── yeast_transcriptome.fa // Kallisto 所需的转录组索引文件，实现基于 pseudo alignment 的转录本定量时才会用到，本文不涉及该文件。
├── reads//双端测序clean data，即已经经历过reads过滤。通常下机的时候公司都会同时给出rawdata和cleandata，直接用后者就好。
│   ├── s1_y_1.fq.gz
│   ├── s1_y_2.fq.gz
│   ├── s2_y_1.fq.gz
│   └── s2_y_2.fq.gz
├── script //脚本文件，需要时加入绝对路径引用该脚本即可。
│   ├── edgeR.R
│   ├── prepDE.py
│   ├── prepDE.py3
│   └── run.sh
└── src//可能用到的软件安装包，服务器如果安装过该软件则无需再次安装。
    ├── fastqc_v0.11.9.zip
    ├── hisat2-2.2.1-Linux_x86_64.zip
    ├── hisat2-2.2.1-OSX_x86_64.zip
    ├── kallisto_linux-v0.46.1.tar.gz
    ├── kallisto_mac-v0.46.1.tar.gz
    ├── samtools-1.14.tar.bz2
    ├── stringtie-2.2.0.Linux_x86_64.tar.gz
    └── stringtie-2.2.0.OSX_x86_64.tar.gz

完整执行代码如下，跑的时候一行行代入即可

$ cd ./genome
$ hisat2-build yeast.fa genome.fa //构建参考基因组索引,hisat2-build之间不要有空格。

//在新建的文件夹执行比对操作
$ cd ..
$ mkdir alignment
$ cd alignment

$ hisat2 -p 6 -x ../genome/genome.fa -1 ../reads/s1_y_1.fq.gz -2 ../reads/s1_y_2.fq.gz -S ./s1.sam //使用hisat2将测序得到的双端测序reads比对到建立好索引的参考基因组。是同一个处理下的双端测序。

$ samtools view -bS s1.sam -o s1.bam //samtools view将sam文件转化为bam文件。bam是sam的二进制文件，二进制转化后占用存储空间更小。
$ samtools sort s1.bam s1.sorted //samtools sort将s1.bam排序，产生s1.sorted.bam。后者会自动加上.bam后缀，无需命令行里添加。
$ samtools index s1.sorted.bam //将排序后的bam文件添加索引

$ stringtie ./s1.sorted.bam -G ../genome/yeast.gff -e -p 2 -o ./s1_out.gtf -A ./s1_genes.list //stringtie根据gtf注释和排序后bam比对结果估算转录本表达量

//用同样的方法得到另一处理下双端测序的比对结果：s2_out.gtf 和 s2_genes.list。此处不再逐一重复。

//在新建的文件夹执行汇总表达量操作
$ cd ..
$ mkdir differential_expression
$ cd differential_expression

$ vim sample_list.txt #手动新建并编辑sample_list.txt文件，内容为两个名称+对应gtf文件的地址。注意第二行不要有换行符号。
// sample_list.txt文件长这个样子，此处把两个gtf文件放在了differential_expression文件夹下。
// s1 /mnt/1223/NGS2021/differential_expression/s1_out.gtf
// s2 /mnt/1223/NGS2021/differential_expression/s2_out.gtf
$ python prepDE.py3 -i sample_list.txt -g gene_count.csv -t transcript.csv //stringtie的脚本生成差异表达基因列表。
// 注意stringtie差异基因汇总脚本有prepDE.py和prepDE.py3两个版本，前者适用于python2环境，后者python3环境。使用混了会报错。本文基于python3.9.5环境。

执行完上述步骤后得到的gene_count.csv即为最终结果，可以导入到R语言用edgeR / DESeq2包进行差异表达基因分析。有机会再整理后继教程。

sam文件基础

sam文件在序列分析中至关重要，无论是转录组分析还是基因组call SNP。认识sam文件所包含的信息有助于理解数据。我们依然以本文中生成sam文件的命令行举例。转录组分析核心比对步骤是使用hisat2将测序得到的reads比对到建立好索引的参考基因组：

$ hisat2 -p 6 -x ../genome/genome.fa -1 ../reads/s1_y_1.fq.gz -2 ../reads/s1_y_2.fq.gz -S ./s1.sam

• -x 参考基因组 .fa文件
• -1 双端测序第1段 .fq.gz格式
• -2 双端测序第2段 .fq.gz格式
• -S 输出文件地址+名字，输出结果为SAM格式
  双端测序一般为read1.fq / read1.fq.gz / read1.fq.bz2格式，前后两端同时出现，并同时作为hisat2输入。将测序得到的fastq文件经过hisat2比对到参考基因组得到SAM文件。SAM文件就是序列比对文件，有上下两个部分，分别包括头部注释部分和比对结果部分：

头部注释部分

//头部注释部分以@开头：
@HD     VN:1.0  SO:unsorted //HD行：VN的版本以及比对排序类型。此处显示SO:unsorted表示没有排列顺序。
@SQ     SN:NC_001133.9  LN:230218//SQ行：参考序列目录。SN：参考序列名字。LN：参考序列长度
@SQ     SN:NC_001148.4  LN:948066
@SQ     SN:NC_001224.1  LN:85779
@SQ     SN:NC_001140.6  LN:562643
@SQ     SN:NC_001141.2  LN:439888
@SQ     SN:NC_001142.9  LN:745751
@SQ     SN:NC_001143.9  LN:666816
@PG     ID:hisat2       PN:hisat2       VN:2.0.5        CL:"/mnt/bai/public/bin/hisat2-2.0.5/hisat2-align-s --wrapper basic-0 -p 8 -x ../genome/genome.fa --dta -S ./s1.sam -1 /tmp/1909596.inpipe1 -2 /tmp/1909596.inpipe2"
//PG行：使用的比对程序名，此处为hisat2

比对结果部分

比对结果部分每行表示一个read和参考基因组的比对结果信息。前11列为主列，包含了大部分重要信息。

SRR5511068.3    99      NC_001147.6     1002516 60      75M     =       1002624 184     GTACTTAACATTCTTCTAATCATGTTAAAAGGTAAAACCTGGCCCATTTTACGATCGATCTGTAAAATCTTATAC     AAAAAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE/EEEEAEEEEEEEEEEEAEEEEEEEAEEEEEEEEEEA     AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:75 YS:i:0  YT:Z:CP NH:i:1
SRR5511068.3    147     NC_001147.6     1002624 60      76M     =       1002516 -184    GATAAGTAAGCAATGGTGGTAATTGCAATATTTTGCATATGTGCACGAGAAGAACTATTTTGAAGTAAGATCACTG    /EEEE<EAEEEEEE6E/EEEEEEEAEEEEEEEAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEAEEEEEEEAAAAA    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:76 YS:i:0  YT:Z:CP NH:i:1
SRR5511068.9    83      NC_001146.8     299462  60      75M1S   =       299435  -103    ATTGGAAAAGAAAGTCGCGGCAAAGAGAAATGCCAATAAGACCGGGAATCAAAATTCTAAAAAGAAGAGTCAGAAG    <EAAA6<A<E/EEA/A</AE/EEEAA<EEAE6AEEAAEEAEEEAAAEE/EEEEEEEEEEEE//EEEEEE/EAAAAA    AS:i:-1 XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:75 YS:i:0  YT:Z:CP NH:i:1

主体部分以tab分隔从左到右依次为：

• QNAME：Query Name，测序reads名称。如果是双端测序则会出现二次，两端各比对上一次。
• FLAG：数值为2的次方数或者其加和，每个2的次方代表一种情况。详情可以参考CSDN大佬的博客：https://blog.csdn.net/genome_denovo/article/details/78712972
  或者简书大佬：
  https://www.jianshu.com/p/ab133ee9712c
• RENAME：Reference Name，双端测序R1比对上的参考序列名，没比上就是*。
• POS：position，双端测序R1起始比对上的位置序号。
• MAPQ：Mapping Quality，质量分数，越高代表越准确。
• CIGAR：比对结果，M代表完全匹配。
• RNEXT：双端测序R2端比对情况，比对不上用*号，比对到同一段用=号。
• MPOS：双端测序R2端比对位置。
• ISIZE：文库插入长度，R2端位置-R1端位置+CIGAR处的值。
• SEQ：序列信息。
• QUAL：reads质量，用ASCII码表示。

最后总结一下：

转录组数据分析步骤不仅仅是比对产生差异表达基因，后继还会涉及差异表达基因的显著性分析，相关性分析，GO和KEGG分析等等。本文只是总结了转录组分析的上游步骤。而就上游步骤而言，可用的比对软件种类也非常多，本文只是借助hisat2+samtools+stringtie的经典步骤来学习转录组上游分析。其他比对软件日后如有涉及再行整理。

标签：fq,samtools,双端,s1,测序,gz,hisat2
来源： https://blog.csdn.net/m0_64240043/article/details/122450444

本站声明： 1. iCode9 技术分享网（下文简称本站）提供的所有内容，仅供技术学习、探讨和分享；
2. 关于本站的所有留言、评论、转载及引用，纯属内容发起人的个人观点，与本站观点和立场无关；
3. 关于本站的所有言论和文字，纯属内容发起人的个人观点，与本站观点和立场无关；
4. 本站文章均是网友提供，不完全保证技术分享内容的完整性、准确性、时效性、风险性和版权归属；如您发现该文章侵犯了您的权益，可联系我们第一时间进行删除；
5. 本站为非盈利性的个人网站，所有内容不会用来进行牟利，也不会利用任何形式的广告来间接获益，纯粹是为了广大技术爱好者提供技术内容和技术思想的分享性交流网站。