标签：DNA 核酸酶 Cas 系统 Cell crRNA 牛文 CRISPR
近日，CRISPR专利大战以张锋一方获胜而暂告一段落。显然，早已风靡生物医学界的CRISPR凭此又火了一把，而Cell杂志三篇牛文则对CRISPR系统及操作进行了详细地归纳总结，可让大家真正掌握CRISPR基因编辑技术之精髓。
CRISPR两大家族
CRISPR-Cas系统是原核生物中的适应性免疫系统，而基于效应蛋白可分为两个不同的类别:Class 1和Class 2。其中，Class 2系统（尤其是基于核酸酶Cas9的系统）已成为最热门的基因编辑工具。
1类CRISPR家族
Class 1系统被分为3个类型、12个亚型（如下图）。多种细菌和古细菌中均含有该类系统，比如嗜热微生物中富含1类III型CRISPR-Cas系统。
除了常见的Cas蛋白外，1类CRISPR-Cas系统中还有一些其他辅助性蛋白，如逆转录酶（RT）、CARF蛋白家族。
该系统在形成获得性免疫记忆时，除了一些不走寻常路的III-B系统（对逆转录酶情有独钟），其他的则是完全仰仗Cas1和Cas2这两个左膀右臂，尤其对Cas1的核酸酶活性十分依赖。通常Pre-crRNA会携手Cas6e/ Cas5d进化为成熟crRNA，并结合相应蛋白组装成复合物形式；而后在外源分子***时，复合物会招募御用的Cas3核酸酶对“侵略者”进行切割瓦解。
点击查看大图
正所谓，道高一尺魔高一丈。外源“侵略者”也不是好欺负的，为了抵抗细菌的这套CRISPR免疫系统，已有某些噬菌体能够编码多种抗CRISPR蛋白（Anti-CRISPR Protein），来进行免疫逃逸。
2类CRISPR家族
目前，2类CRISPR-Cas系统被分为3种类型、9个亚型。该系统的大多数会编码Cas1、Cas2和一些辅助蛋白如Cas4，而只有VI型系统独树一帜，仅由CRISPR阵列和效应蛋白组成。
2类系统主要有3类效应蛋白：RuvC样核酸酶结构域（RNA酶H折叠）、HNH家族核酸酶和HEPN超家族的两个核糖核酸酶结构域。且不同于1类CRISPR，CRISPR/Cas9系统在清除外源基因的过程中有着特殊的机制：首先需要tracrRNA，其次需要体内RNaseIII的参与。
另外，对外源基因常被CRISPR/Cas9系统KO的方式如下：1）tracrRNAs和pre-crRNA中的重复片段区域杂交，Cas9和crRNA-tracrRNA结合；2）RNase III从spacer的5’端开始剪切，产生不同类型的成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9的复合物；而后复合物通过PAM位点与相匹配的外源基因结合并剪切。
目前2类系统主要应用于以下三个方面：1）基因编辑，包括基因敲除、基因敲入以及引发突变；2）基因调控以及递送各种功能的部件（如转录因子）到DNA中特定的位置；3）靶向***NA。
CRISPR操作的中心法则
当外源dsDNA被注入细胞时，Cas1/2蛋白可识别外源DNA原间隔序列临近基序（PAM：三碱基NGG，N为任意碱基），并将原间隔序列（protospacer）剪切并插入到CRISPR序列前导区的下游中，完成外源DNA的捕获。
在I型和III型系统中，初始CRISPR转录产物（Pre-crRNA）会被CRISPR特异性核酸内切酶（Cas6 / Cas5d）在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA。
在II型系统中，Pre-crRNA可通过重复序列与其互补序列transacting RNA（trancrRNA）反式结合，然后在Cas9存在的情况下被RNaseIII加工融合成一个sgRNA。
I型和II型系统均可靶向含有与PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。不同的是，在I型系统中，通过含有多个亚型的复合物结合到dsDNA，并招募反式核酸酶Cas3对DNA进行靶向干扰。在II型系统中，则通过Cas9蛋白的HNH酶活性剪切crRNA互补的DNA链及其RuvC活性位点剪切非互补链，促使dsDNA断裂。
类似于I型系统，III型系统也同样依赖于具有核酸酶活性的多亚基复合物对靶向DNA进行干扰，但不同于I型和II型系统，III型系统不依赖于PAM进行靶标位点的识别，而是通过碱基互补配对来识别靶序列并进行DNA的裂解。
参考文献：1、SnapShot: Class 1 CRISPR-Cas Systems
2、SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems
3、SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems
标签：DNA,核酸酶,Cas,系统,Cell,crRNA,牛文,CRISPR 来源： https://blog.51cto.com/u_15127638/2777808
本站声明： 1. iCode9 技术分享网（下文简称本站）提供的所有内容，仅供技术学习、探讨和分享； 2. 关于本站的所有留言、评论、转载及引用，纯属内容发起人的个人观点，与本站观点和立场无关； 3. 关于本站的所有言论和文字，纯属内容发起人的个人观点，与本站观点和立场无关； 4. 本站文章均是网友提供，不完全保证技术分享内容的完整性、准确性、时效性、风险性和版权归属；如您发现该文章侵犯了您的权益，可联系我们第一时间进行删除； 5. 本站为非盈利性的个人网站，所有内容不会用来进行牟利，也不会利用任何形式的广告来间接获益，纯粹是为了广大技术爱好者提供技术内容和技术思想的分享性交流网站。