标签：活体 1.00 细胞系 06Fluc 基因 荧光素酶 发光 阳性 成像
一、技术原理
1. 标记原理
哺乳动物生物发光，一般是将 Firefly luciferase 基因（由 554 个氨基酸构成，约 50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体 DNA 上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素 (luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在 ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
除 Firefly Luciferase 外，有时也会用到 Renilla Luciferase。二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是 coelentarizine。二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在 540~600nm，后者所发的光波长在 460~540nm 左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用 Firefly Luciferase 作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素在氧气、ATP 存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素 (oxyluciferin)，并产生发光现象。
对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子 luxABCDE 或 luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。
2. 底物荧光素的特点
荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：
① 荧光素不会影响动物的正常生理功能。
② 荧光素是 280 道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。
③ 荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢，持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约 1min 后表达荧光素酶的细胞开始发光，10min 后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约 20~30 min 后开始衰减，约 3h 后荧光素排除，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后 15~35min 之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是 150mg/kg，即体重 20 克的小鼠需要 3 毫克的荧光素。
④ 观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。
3. 光学原理
光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于 600 纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减 10 倍，血液丰富的组织或器官（比如心脏、肝脏、肺脏）衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。
二、活体生物发光成像技术应用领域
活体生物发光成像技术是一项在某些领域有不可替代优势的技术，比如肿瘤转移研究、药物开发、基因治疗、干细胞示踪等方面。
1. 肿瘤学
活体生物发光成像技术能够让研究人员能够直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到，比传统方法的灵敏度大大提高了；非常适合于肿瘤体内生长的定量分析；避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本。由于以上特点，使基于转移模型、原位模型、自发肿瘤模型等方面的肿瘤学研究得到发展。建立肿瘤转移模型，可以观察肿瘤转移情况，进一步探讨肿瘤转移的机制；可进行原位接种，观察原位以及原位转移模型，使肿瘤学研究更接近肿瘤临床发病的微观环境；通过建立自发肿瘤模型，可以观察肿瘤发生机理。
2. 药物研究
在药效学评价方面，荧光素酶癌症模型可用于癌症体内用药在整体动物水平上进行长期疗效跟踪观察。利用无创伤活体成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞的变化进行实时观测和评估。这种方式提供一个很好的对癌细胞的反应和复发评估的预诊断途径。用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法还不能检测到瘤块时，用该技术已经可以检测到很强的信号。由于该技术只是检测活细胞，不能检测已经凋亡的细胞。而用传统的方法，不能区别正常细胞与凋亡的细胞，所以该技术可以比传统技术更早更灵敏的发现药物的疗效。
利用活体成像技术高灵敏度、观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同剂量，不同给药时间、不同给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量及给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。
在药物代谢方面，标记与药物代谢有关的基因，比如 CYP3A4 等，研究不同的药物对该基因表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况。
在药剂学研究方面，可以通过把荧光素酶报告基因的质粒直接装载在药物载体中，观察药物载体的靶向脏器与体内分布规律（图 2）。在药理学方面，还可以通过转基因小鼠的应用，观察药物作用的通路，用荧光素酶基因标记某一个兴趣基因，观察药物作用的通路。
一、技术原理
1. 标记原理
哺乳动物生物发光，一般是将 Firefly luciferase 基因（由 554 个氨基酸构成，约 50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体 DNA 上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素 (luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在 ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
除 Firefly Luciferase 外，有时也会用到 Renilla Luciferase。二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是 coelentarizine。二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在 540~600nm，后者所发的光波长在 460~540nm 左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用 Firefly Luciferase 作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素在氧气、ATP 存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素 (oxyluciferin)，并产生发光现象。
对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子 luxABCDE 或 luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。
2. 底物荧光素的特点
荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：
① 荧光素不会影响动物的正常生理功能。
② 荧光素是 280 道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。
③ 荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢，持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约 1min 后表达荧光素酶的细胞开始发光，10min 后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约 20~30 min 后开始衰减，约 3h 后荧光素排除，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后 15~35min 之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是 150mg/kg，即体重 20 克的小鼠需要 3 毫克的荧光素。
④ 观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。
3. 光学原理
光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于 600 纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减 10 倍，血液丰富的组织或器官（比如心脏、肝脏、肺脏）衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。
二、活体生物发光成像技术应用领域
活体生物发光成像技术是一项在某些领域有不可替代优势的技术，比如肿瘤转移研究、药物开发、基因治疗、干细胞示踪等方面。
1. 肿瘤学
活体生物发光成像技术能够让研究人员能够直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到，比传统方法的灵敏度大大提高了；非常适合于肿瘤体内生长的定量分析；避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本。由于以上特点，使基于转移模型、原位模型、自发肿瘤模型等方面的肿瘤学研究得到发展。建立肿瘤转移模型，可以观察肿瘤转移情况，进一步探讨肿瘤转移的机制；可进行原位接种，观察原位以及原位转移模型，使肿瘤学研究更接近肿瘤临床发病的微观环境；通过建立自发肿瘤模型，可以观察肿瘤发生机理。（图 1）
2. 药物研究
在药效学评价方面，荧光素酶癌症模型可用于癌症体内用药在整体动物水平上进行长期疗效跟踪观察。利用无创伤活体成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞的变化进行实时观测和评估。这种方式提供一个很好的对癌细胞的反应和复发评估的预诊断途径。用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法还不能检测到瘤块时，用该技术已经可以检测到很强的信号。由于该技术只是检测活细胞，不能检测已经凋亡的细胞。而用传统的方法，不能区别正常细胞与凋亡的细胞，所以该技术可以比传统技术更早更灵敏的发现药物的疗效。
利用活体成像技术高灵敏度、观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同剂量，不同给药时间、不同给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量及给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。
在药物代谢方面，标记与药物代谢有关的基因，比如 CYP3A4 等，研究不同的药物对该基因表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况。
在药剂学研究方面，可以通过把荧光素酶报告基因的质粒直接装载在药物载体中，观察药物载体的靶向脏器与体内分布规律（图 2）。在药理学方面，还可以通过转基因小鼠的应用，观察药物作用的通路，用荧光素酶基因标记某一个兴趣基因，观察药物作用的通路。
3. 基因治疗
基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。目前，基因治疗主要是以病毒做载体，可应用荧光素酶基因作为报告基因加入载体，观察目的基因是否到达动物体内的特异组织和是否持续高效表达，这种非侵入方式具有低毒性及免疫反应轻微等优点且可以直接实时观察，了解病毒或载体侵染的部位和时域信息；荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的 DNA 分子中，用来观察脂质体为载体的 DNA 运输和基因治疗情况；也可以表达荧光素酶基因的质粒裸 DNA 为模型 DNA，直接注入动物体内，利用生物发光成像可以分析不同载体、不同注射位点、不同注射量对荧光素酶基因表达的影响，同时也可以时空量化分析基因表达的分布、水平和持续时间。这种可视的方法直观地评价 DNA 的转染效率和表达效率，在基因治疗研究中具有重要的指导作用。
4. 干细胞及免疫学
用荧光素酶标记干细胞有以下几种方法：一种是标记组成性表达的基因，做成转基因动物，干细胞就被标记了，若干细胞移植到另外动物体内，可以用活体生物发光成像技术示踪干细胞在体内的增殖、分化及迁徙的过程；另外一种方法是用慢病毒直接标记干细胞后，移植到体内观测其增殖、分化及迁徙过程，研究其修复、治疗损伤或缺陷部分的效果，进一步探讨其机制。
可以通过标记免疫细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞等的识别和杀死功能，评价免疫细胞的免疫特异性、增殖、迁移及功能等；通过标记异体细胞，观察异体细胞对器官移植影响；也可进行一些关于免疫因子的研究等。
5. 基因表达模式与基因功能研究
研究基因表达可以从影响基因表达的各个不同的层面进行相关的研究，如利用融合蛋白（p27-luc 融合蛋白研究其在 Cdk 细胞分裂周期的表达），兴趣基因启动子控制的荧光素酶（Catenin 在肿瘤转移的信号传导机制），siRNA 方式和转基因动物等方法。
为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。通过这种方法实现荧光素酶和目的基因的平行表达，从而可以直接观察目的基因的表达模式，包括数量、时间、部位及影响其表达和功能的因素等；也可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，观察药物诱导特定基因表达；以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。
6. 蛋白质相互作用
可利用动物体内生物发光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用。其原理是将分开时都不单独发光的荧光酶的 C 端和 N 端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用，荧光酶的 C 端和 N 端就会被连接到一起，激活荧光素酶的转录表达，在有底物存在时出现生物发光。在活体条件下研究药物对蛋白质相互作用的影响，可以观察到在体外实验中无法模拟的活体环境对蛋白质相互作用的影响。
7. 细胞凋亡
利用活体动物生物发光成像技术，直接观察活体动物体内的细胞凋亡。具体原理是用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白 (如雌激素)，但在其连接处加上 caspase (细胞凋亡时特异表达的一种酶) 的酶切点。细胞发生凋亡时，表达 caspase，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光素酶开始发光。
8. 疾病机理
可以标记与某种疾病密切相关的基因，做成转基因小鼠，通过特定的药物作用或其他条件下该基因表达的变化，来推测该疾病的发病机理和药物对疾病治疗的效果等。
9. 其他
如 RNAi、蛋白质核运输等。在荧光素酶基因的一端接要研究的蛋白质的基因，另一端接肯定在细胞核内表达的蛋白的基因，当核外的蛋白运输到核内时，就会导致荧光素酶 N 端、C 端靠近，恢复发光。
图 2 利用 IL-1Β转基因小鼠筛选抗炎症药物
3. 基因治疗
基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。目前，基因治疗主要是以病毒做载体，可应用荧光素酶基因作为报告基因加入载体，观察目的基因是否到达动物体内的特异组织和是否持续高效表达，这种非侵入方式具有低毒性及免疫反应轻微等优点且可以直接实时观察，了解病毒或载体侵染的部位和时域信息；荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的 DNA 分子中，用来观察脂质体为载体的 DNA 运输和基因治疗情况；也可以表达荧光素酶基因的质粒裸 DNA 为模型 DNA，直接注入动物体内，利用生物发光成像可以分析不同载体、不同注射位点、不同注射量对荧光素酶基因表达的影响，同时也可以时空量化分析基因表达的分布、水平和持续时间。这种可视的方法直观地评价 DNA 的转染效率和表达效率，在基因治疗研究中具有重要的指导作用。
4. 干细胞及免疫学
用荧光素酶标记干细胞有以下几种方法：一种是标记组成性表达的基因，做成转基因动物，干细胞就被标记了，若干细胞移植到另外动物体内，可以用活体生物发光成像技术示踪干细胞在体内的增殖、分化及迁徙的过程；另外一种方法是用慢病毒直接标记干细胞后，移植到体内观测其增殖、分化及迁徙过程，研究其修复、治疗损伤或缺陷部分的效果，进一步探讨其机制。
可以通过标记免疫细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞等的识别和杀死功能，评价免疫细胞的免疫特异性、增殖、迁移及功能等；通过标记异体细胞，观察异体细胞对器官移植影响；也可进行一些关于免疫因子的研究等。
5. 基因表达模式与基因功能研究
研究基因表达可以从影响基因表达的各个不同的层面进行相关的研究，如利用融合蛋白（p27-luc 融合蛋白研究其在 Cdk 细胞分裂周期的表达），兴趣基因启动子控制的荧光素酶（Catenin 在肿瘤转移的信号传导机制），siRNA 方式和转基因动物等方法。
为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。通过这种方法实现荧光素酶和目的基因的平行表达，从而可以直接观察目的基因的表达模式，包括数量、时间、部位及影响其表达和功能的因素等；也可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，观察药物诱导特定基因表达；以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。
6. 蛋白质相互作用
可利用动物体内生物发光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用。其原理是将分开时都不单独发光的荧光酶的 C 端和 N 端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用，荧光酶的 C 端和 N 端就会被连接到一起，激活荧光素酶的转录表达，在有底物存在时出现生物发光。在活体条件下研究药物对蛋白质相互作用的影响，可以观察到在体外实验中无法模拟的活体环境对蛋白质相互作用的影响。
7. 细胞凋亡
利用活体动物生物发光成像技术，直接观察活体动物体内的细胞凋亡。具体原理是用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白 (如雌激素)，但在其连接处加上 caspase (细胞凋亡时特异表达的一种酶) 的酶切点。细胞发生凋亡时，表达 caspase，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光素酶开始发光。
8. 疾病机理
可以标记与某种疾病密切相关的基因，做成转基因小鼠，通过特定的药物作用或其他条件下该基因表达的变化，来推测该疾病的发病机理和药物对疾病治疗的效果等。
9. 其他
如 RNAi、蛋白质核运输等。在荧光素酶基因的一端接要研究的蛋白质的基因，另一端接肯定在细胞核内表达的蛋白的基因，当核外的蛋白运输到核内时，就会导致荧光素酶 N 端、C 端靠近，恢复发光。
发光细胞——小鼠活体成像实验材料：
小鼠活体成像是科学研究和药物研发的常用方法。进行此实验的前提是必须要有能稳定表达发光基因的细胞。常用的发光基因包括萤火虫萤光素酶（firefly luciferase，Fluc）、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（tdTomato）。本部分汇集了几种常用的稳定转染了Fluc的癌细胞系，并从Fluc、GFP、tdTomato转基因动物体内分离得到了发光的免疫细胞。这些细胞是进行基础研究和药物研发的常用工具。
标签：活体,1.00,细胞系,06Fluc,基因,荧光素酶,发光,阳性,成像 来源： https://blog.csdn.net/Bio12345/article/details/111993738
本站声明： 1. iCode9 技术分享网（下文简称本站）提供的所有内容，仅供技术学习、探讨和分享； 2. 关于本站的所有留言、评论、转载及引用，纯属内容发起人的个人观点，与本站观点和立场无关； 3. 关于本站的所有言论和文字，纯属内容发起人的个人观点，与本站观点和立场无关； 4. 本站文章均是网友提供，不完全保证技术分享内容的完整性、准确性、时效性、风险性和版权归属；如您发现该文章侵犯了您的权益，可联系我们第一时间进行删除； 5. 本站为非盈利性的个人网站，所有内容不会用来进行牟利，也不会利用任何形式的广告来间接获益，纯粹是为了广大技术爱好者提供技术内容和技术思想的分享性交流网站。