标签：Rex 扩增 细胞培养 培养基 浸润 细胞 TIL 方法学

摘要

自体体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）已成功用于治疗黑色素瘤患者。肿瘤中TIL的扩增通常分两个步骤进行。该程序的细节在不同的实验室之间有所不同，但是总体概念保持不变。第一步，将肿瘤的小片段置于含有一种或多种刺激T细胞的生长因子的培养基中。这里介绍了使用白介素（IL）-2的最常见方法。第一步的长度是灵活的，以允许生成足够的细胞以启动该过程的第二步。第二步是所谓的快速扩增方案（REP），其中第一步中收获的TIL在过量饲养细胞和T细胞刺激性生长因子的存在下通过触发其T细胞受体（TCR）复合物而诱导大量增殖。第二个扩增步骤通常需要2周左右的时间。本文描述的REP使用可溶的抗CD3抗体触发TCR，将辐照的外周血单核细胞（PBMC）用作饲养细胞，并将IL-2用作T细胞生长因子。此外，所描述的方案利用可透气的细胞培养瓶，其产生大量的细胞，类似于常规生物反应器，但是使用标准实验室设备。

 

1引言

通过过继转移自体体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗黑素瘤患者已显示出令人印象深刻的临床结果。TIL过继细胞疗法（ACT）领域是由美国国家癌症研究所（NCI）的Steven Rosenberg教授的研究小组开创的，1988年已经发表了有关黑色素瘤患者成功进行TIL ACT的第一批报道[1,2]。此后，许多其他小组在黑素瘤中进行了TIL ACT试验，成功率相似[3,4,5,6,7,8,9]。

 

已经证明，TIL ACT疗法在黑素瘤中的功效取决于几个因素。首先，需要对患者进行免疫抑制化学治疗。没有这种预处理，TIL将不会持续，并且在大多数情况下治疗将不会成功。预处理被认为可以消除免疫抑制性免疫细胞，并同时为输注的TIL创造一个有利环境，在竞争性T细胞缺失后，刺激性可溶性因子的可用性和细胞间相互作用将增加。其次，通常通过支持T细胞存活和扩增的IL-2或其他细胞因子的输注来支持输注的TIL。

 

第三，相对于此处介绍的方案，注入的TIL产品的特性对治疗结果有很大影响。输注更多数量的细胞通常与更好的治疗效果相关[4,9]。但是，细胞产物的质量也起着重要作用，较短时间培养的所谓年轻TIL优于较长时间培养的TIL。

 

大多数实验室都有自己的方案来刺激肿瘤中TIL的生长和扩增。但是，所有方法均来自Rosenberg组的方法，并且一般过程相同。TIL扩增通常分为两部分（图1）。首先，将切除的肿瘤或肿瘤活检分为小片段（甚至单细胞悬液），将其放入具有T细胞刺激性生长因子的细胞培养基中。一旦获得足够的TIL数量（通常需要2至4周），便会对其进行快速扩增方案（REP），在存在刺激T细胞的生长因子和饲养细胞的情况下，通过触发T细胞受体复合物来刺激增殖。将饲养细胞过量添加到培养物中，使用的饲养细胞比添加的TIL多100-300倍。起始培养物中TIL的量很低，通常在1×103~1×104的范围内TIL每毫升细胞培养基。通常在大约2周后收获REP培养物，然后产生的TIL会比在REP开始时添加的TIL多出1000倍。

 

图1. 从黑色素瘤肿瘤中扩增肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的一般操作流程。该过程分为两个步骤。步骤1用于从肿瘤材料中扩增TIL，步骤2用于通过快速扩增（REP）方法大量增加第一步中获得的TIL的量

本文方案将描述先在高剂量IL-2存在下在24孔培养板中培养肿瘤片段从黑色素瘤肿瘤中扩增TIL。2-4周扩增后，收获细胞并进行REP。要开始REP，需要在透气的培养瓶中加入少量的TIL [10,11,12,13]在抗CD3抗体和大剂量IL-2存在下，用过量的照射自体或同种PBMC作为饲养细胞。整个方案中使用的培养基都是无血清的，但仍要补充2％的自体或异源人血清，因为这会大大增加T细胞的扩增。总之，从肿瘤扩增TIL的方法很简单。但是，有许多动手技巧和窍门将有助于该过程，并同时改善所生成细胞的数量和质量。

 

2材料

2.1总则

1. 一般细胞培养设备和耗材，例如移液器，吸头，试管等。

2. LAF-bench。

3. 细胞培养培养箱设置在37°C，5％CO2。

4. 带有旋转转子的离心机。

5. 倒置显微镜。

6. 细胞计数器或计数室，用于手动计数。

7. 0.4％台盼蓝。

8. 完整细胞培养基：CellGenix GMP DC培养基（CellGenix，请参见注释1），其中补充了2％的人血清（自体或同种异体供体AB血清的混合物，请参见注释2）。

9. IL-2（请参阅注3）。

10. 可选：如果TIL产品在开始REP步骤之前冻存，冷冻介质用90％的人血清补充了10％的二甲亚砜。

11. 可选：如果TIL产品在开始REP步骤之前冻结，细胞冷冻容器。

 

2.2从肿瘤材料扩增TIL

1. 运输媒介。CellGenix GMP DC培养基（CellGenix）+可选添加100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素。

2. 初始培养基。完整细胞培养基+可选添加100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素。

3. 运输容器。无菌容器，大小适合拿到的肿瘤/活检组织块。

4. 培养皿。

5. 无菌镊子。

6. 手术刀。

7. 24孔细胞培养板（见注4）。

 

2.3快速扩增方法

1. 水浴设定在37°C。

2. G-Rex 100 M透气烧瓶（Wilson Wolf，请参阅注释4）。

3. OKT3，抗CD3抗体（请参阅注释5）。

4. PBMC（自体或同种异体献血者的PBMC混合物，请参见注释2）。

5. 可选：如果第一步扩增的TIL产品被冷冻，TIL解冻介质：9 mg/ml NaCl补充有8％抗凝柠檬酸盐葡萄糖溶液。

6. 可选：如果饲养细胞的质量较低或未知（请参阅注释6）。Pulmozyme缓冲液：细胞培养基中含有0.025 mg/ml Pulmozyme（Roche）和2.5 mM MgCl2。

7. 可选：如果要将产品重新回输入患者体内（请参阅注释7）。输液缓冲液：9 mg/ml NaCl补充2.5％人血清白蛋白（HSA）。

 

3 方法

3.1从肿瘤材料扩增TIL

1. TIL扩增的起始材料是切除的肿瘤或肿瘤活检（参见注释8）。将肿瘤样品在无菌运输容器中的运输介质中运送到实验室，该运输介质由具有或不具有抗生素的细胞培养基组成（请参见注释9）。

2. 将含有6000 IU/ml IL-2并任选添加抗生素的1.5 ml完整细胞培养基（见注9）添加到24孔板的孔中。制备的孔数取决于所接受的肿瘤材料的量。

3. 使用无菌镊子从运输容器中取出肿瘤，并将其置于培养皿中。从此刻开始，动作要快以避免组织变干。

4. 将肿瘤的周围组织尽可能切除干净。尤其重要的是去除残留的皮肤，因为这是微生物污染的很大风险因素（请参见注释9）。

5. 将肿瘤切成约1~3 mm3的小片段，每个片段都放入预先装有培养基的孔中。

6. 将孔板置于细胞培养箱中。

7. 设置后一天，然后每隔第二至第三天，通过倒置显微镜检查每个孔，以监控孔的污染和TIL的增长。

8. 受污染的孔（请参阅注9）。被微生物污染的孔被丢弃。污染通常会导致肉眼可见中等颜色变化和有雾的培养物，但在某些情况下，微生物生长缓慢且仅在显微镜下可见。小心操作，避免污染其他孔。清空污染孔。通过替换各孔之间的所有移液器吸头等，将可疑孔与其他孔分开处理。

9. 包含TIL的孔。TIL的特征是圆形或略微拉长的形状，以及它们倾向于在较小或较大簇中生长。用TIL覆盖孔的底部至少50％，通过用1 ml移液管吸头上下吸移轻轻地重悬孔的内容，并将一半（或更少）的体积转移到一个或多个新孔中。然后将补充有6000 IU/ml IL-2的新鲜完全细胞培养基添加到每个拆分孔中。选择拆分到一个或多个孔是通过考虑孔的汇合度，细胞的扩增速率和下一次监测的时间来进行的。

10. 剩余的孔。对于所有未拆分的孔，通过从孔的顶部小心移液0.75 ml培养基，而不干扰底部的细胞，然后添加0.75 ml的新鲜完整细胞培养基（补充6000 IU/ml IL-2），将一半培养基换为新培养基。

11. 当估计从肿瘤中长出足够的TIL以能够开始REP时，就收集细胞（请参见注释10）。对于底部完全覆盖的每个孔，大约有1-2×106的TIL。对于将要为REP设置的每个G-Rex 100 M烧瓶，需要5×106 TIL。根据所接收的肿瘤量，TIL扩增的功效和要设置的G-Rex烧瓶数量，TIL扩增的第一部分通常需要2至4周。时间范围的下限是可取的。用1毫升移液器吸头上下吸打收获TIL。将来自几个孔的TIL收获混合一起。不要合并没有TIL或很少有TIL的孔，有大量碎片/细胞死亡的孔，或怀疑有污染的孔（请参阅注9）。

12. 如果REP是从新鲜的TIL开始的，请确保在收获前准备好用于启动REP的所有试剂，包括融化和照射饲养细胞。然后如上所述并在REP部分中收获细胞。

13. 可选：如果无法立即启动REP，则可以冻存TIL（请参见注释11）。如上所述收获细胞，通过台盼蓝染色计数并确定活力，然后将试管以300×g离心7分钟。根据未来需要的细胞数，每5–200×106个活的TIL加入1 ml冷冻培养基。分配到冷冻管中，并放置在冷冻容器中，该容器放置在-80°C的冰箱中至少1天，然后转移到−150°C的冰箱/液氮中。

 

3.2快速扩增方法

1. 可选：如果在第一个扩增步骤后将TIL冷冻，则应在开始REP之前将其解冻并在含有6000 IU/ml IL-2的完全细胞培养基中静置1-2天。

2. 解冻在37°C水浴中进行。

3. 此后，将细胞迅速转移到装有10 ml TIL解冻培养基的试管中，并以300×g离心7分钟。

4. 将细胞重悬于完全细胞培养基中，该培养基中添加了6000 IU/ml IL-2，终浓度是每毫升超过1×106个细胞。

5. 计数细胞并通过台盼蓝染色确定活力。

6. 用补充有6000 IU/ml IL-2的完全细胞培养基将浓度调节至1×106活TIL/ml。

7. 将细胞以每孔1.5ml接种在24孔板中。

8. 当开始REP时，如描述扩增的第一部分和以下部分中所述，收获TIL。

9. 每个G-Rex 100 M烧瓶装满875 ml具有3000 IU/ml IL-2的完全细胞培养基，并将其置于细胞培养箱中以加热培养基。

10. 准备管融化饲养细胞。一个装有40 ml完整细胞培养基的50 ml试管，可添加或不添加Pulmozyme和MgCl2（请参见注释6），可加入多达1.5×109 PBMC。每个G-Rex 100 M烧瓶需要0.5×109饲养细胞，但融化会导致细胞损失高达50％。因此，建议解冻所需PBMC的两倍。PBMC可以是自体的，也可以是至少三名经过适当检测排除病毒感染的同种异体供者的混合物（请参见注释2）。

11. 解冻在37°C水浴中进行。

12. 此后，细胞被迅速转移到准备好的试管中。

13. 将管以40 Gy辐照。

14. 将试管以300×g离心7分钟。

15. 将细胞重悬于几毫升完全培养基中（以避免聚集），然后用含3000 IU/ml IL-2的完全细胞培养基补充至40毫升。

16. 如果有可见的聚集体，请尝试通过移液将其解离。不然，请用移液器除去聚集体。团块很粘，可能导致最终TIL产量降低。

17. 计数细胞，并通过台盼蓝染色确定活力。

18. 对于将要设置的每个G-Rex烧瓶，制备100 ml的细胞悬浮液，在含有3000 IU / ml IL-2的完全细胞培养基中总共含有0.5×109活的PBMC。

19. 将OKT3抗体以300 ng/ml的浓度添加到饲养混合物中（G-Rex 100 M烧瓶中的最终浓度为30 ng/ml）。

20. 将100 ml饲养混合物/ OKT3混合物添加到每个G-Rex烧瓶中。

21. 如上述TIL扩增第一部分所述，收获TIL。

22. 通过台盼蓝染色计数并确定活力。

23. 将5×106TIL倒入试管中，以放置每个G-Rex烧瓶。其余部分可以按照TIL扩增的第一部分中的说明进行冻存（若REP是从先前冻存的TIL开始的，不应重复冻存）。

24. 以300×g离心7分钟。

25. 用25 ml完全细胞培养基重悬，每5×106细胞中添加3000 IU/ml IL-2。

26. 将25 ml TIL悬浮液添加到每个G-Rex 100 M烧瓶中。

27. 将烧瓶置于细胞培养箱中。

28. 在第5天，将新的IL-2加入烧瓶中，使其终浓度为3000 IU/ml（假设所有IL-2均已消耗）。

29. 在第7天，换新培养基。小心地将一半（即500 ml）条件培养基从烧瓶中移出，而不会干扰底部的细胞，并加入500 ml含有6000 IU/ml IL-2的新鲜完整细胞培养基（终浓度为3000 IU /ml，假设已经消耗了所有IL-2）。

30. 在第9天，将新的IL-2加入烧瓶中，使其终浓度为3000 IU/ml（假设所有IL-2均已消耗）。从第9天开始，您还可以选择收集细胞，此时细胞数量较少但耗竭状态的细胞占比也较少。

31. 在第12天，将新的IL-2加入烧瓶中，使其终浓度为3000 IU/ml（假设所有IL-2均已消耗）。

32. 最晚在第14天，收获细胞。通常，每个G-Rex此时将产生2–5×109TIL。

33. 用移液器吸出并丢弃尽可能多的培养基，而不会干扰烧瓶底部的细胞。通常，至少700毫升可以丢弃。

34. 通过旋转摇动烧瓶重悬细胞。

35. 将细胞收集到离心管中。

36. 通过台盼蓝染色计数并确定活力。

37. 以300×g离心7分钟。

38. 如果要将细胞回输入患者体内（请参见注释7），则将其重悬于输液缓冲液中，并以300×g的速度再次离心7分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于输注缓冲液中，并转移至输液袋中。在袋子中添加更多的输液缓冲液，直到细胞浓度为每毫升20–150×106为止。

39. 如果要冷冻细胞，则将其重悬于冷冻培养基中，每20–200×106细胞1毫升，于冷冻管中。将其放入冷冻容器中，然后将其放入-80°C的冰箱中至少1天，然后转移至−150°C的冰箱/液氮中。

 

4注释

1. 该方法描述了在两个扩增步骤中均使用CellGenix GMP DC培养基（CellGenix）+ 2％人血清。这种无血清培养基是为DC生成而优化的GMP级培养基，但也可用于T细胞扩增。但是，为了有效地扩增T细胞，应补充2％的人血清。可以将这种培养基更换为适合培养T细胞的另一种培养基，但是如果选择另一种无血清的培养基，则在大多数情况下，尤其是在方案的早期阶段，通过添加血清可以提高细胞产量。一些方法在TIL扩增过程中切换培养基，通常从扩增开始时的较高血清含量移至扩增结束时的无血清培养基。

2. 使用自体血清和饲养细胞进行TIL扩增的风险降低了，而且不可能发生供体来源的感染或免疫反应。但是，有一些缺点。通常很难从患者那里获得足够的血清和饲养细胞。由于癌症，自体血液制品也有免疫抑制的风险。另外，认为TIL和同种异体饲养者之间的同种异体反应可增强扩增。因此，尽管使用过自体饲养细胞和血浆[8]，大多数实验室使用同种异体产品。但是，显然必须通过微生物测试确认这些产品是安全的。关于血清，仅应使用男性AB血清。对于饲养细胞，通常使用来自三个或更多同种异体供血者的混合照射的PBMC。应混合使用多个供体，以减少对TIL扩增产生负面影响的风险，但为确保获得良好结果，应预先测试饲养细胞的T细胞扩增能力。此外，为确保在TIL收获之日不存在活的饲养细胞，应与REP平行建立仅饲养细胞的培养物（包含照射的PBMC，抗CD3和IL-2，但不含TIL）。

3. 在最初刺激肿瘤片段和REP产生TIL的过程中，都添加了刺激T细胞的生长因子。最常见的是IL-2，但在这里也使用了其他细胞因子，并暗示可以产生更高质量的TIL产品。例如，据报道，IL-7，IL-15或IL-21刺激的T细胞扩增可导致更多的记忆和/或干细胞样T细胞亚群[14,15,16,17,18]。

4. 还使用了不同的细胞培养容器。在第一个扩增步骤中，大多数小组使用孔板，但也可以使用更大的培养皿。使用孔板的优势在于TIL不会从所有片段中生长出来，而使用孔板时，就有机会选择TIL正在生长的孔。另外，如果发生感染/污染，则可以将其限制在某些孔中，并且可以拯救其余的孔，而不是丢弃整个TIL培养物。另外，也可以对不同孔进行功能测试，尽管由于增加了培养时间很少这样做。

   在REP中，通常将培养物置于静态烧瓶中，并加入新鲜培养基，或者随着扩增的进行将培养物分开。静态培养物可以在整个扩增过程中保持，但是通过将培养物移入生物反应器中几天后，细胞产量会显着增加，从而可以连续控制培养基条件和细胞浓度[21,22]。但是，生物反应器不是大多数实验室的标准设备，此外，使用它们会增加培养基的消耗，从而大大增加成本。生物反应器的替代品是在所述方案中使用的透气G-Rex烧瓶[10,11,12,13]。它们是静态的，但在底部具有大的透气膜，细胞会在那里沉积。由于气体交换发生在烧瓶的底部，因此与标准烧瓶相比，它们可以充满更多的培养基，从而最大限度地减少了操作需求。将烧瓶放置在正常的细胞培养箱中，因此可以在任何标准实验室中使用。培养基的更换可以手动进行，尽管烧瓶的封闭系统也有带管路的变型，可以连接至培养基泵。

5. 在REP期间，通过触发TCR复合体来刺激TIL扩增。在所描述的方案中，只有CD3被激动抗体靶向，但是有出版物表明，TCR复合物和共刺激分子（如CD28或4-1BB）的联合触发可产生更好的TIL产品[14,18,19,20]。此外，某些方法使用固定在培养容器表面，微珠或人工APC上的激动性抗体。最常用的方法仍是通过可溶性抗CD3抗体触发TCR，如本文所述。将抗CD3简单地添加到培养物中，让它们通过Fc受体与过量添加到培养物中的饲养细胞结合。

6. 饲养细胞的质量对于REP的扩增至关重要。此处的方案描述了添加比TIL多100倍的饲养细胞，并且使用较低的饲养细胞与TIL比率将导致较低的产量。因此，需要大量的饲养细胞。

   可能出现的一个问题是在解冻和/或辐照期间用作饲养细胞的PBMC中细胞聚集的形成。聚集体的存在将导致饲养细胞的可用性降低，数量减少。另外，聚集体发粘，也可能粘在TIL细胞上，导致最终产量降低。

   饲养细胞中细胞聚集体的形成可能是由于PBMC被血小板和/或粒细胞污染或死细胞的存在。仔细遵循PBMC制备的标准规程，包括慢速离心以降低血小板频率，可以避免细胞聚集。如果改为使用白细胞去除术产品作为PBMC的来源，则应建立白细胞去除术，以限制产品中粒细胞的数量。此外，正确进行冷冻和解冻对于避免融化的PBMC中死细胞的高频率很重要，而死细胞总是与聚集体形成有关。此外，可选的Pulmozyme和MgCl2缓冲液可以独立于饲养细胞源使用，以最大程度地减少融化和照射饲养细胞时发生聚集的风险。最后，如果在PBMC中仍然出现聚集，则应尝试解离团块，如果未成功，则应除去团块。

7. 如果将细胞产品用于实际的患者治疗，则必须在无尘室设施中按照良好生产规范（GMP）进行操作，并且必须对所有材料进行相应的认证。无菌测试应在手术过程中的不同时间点进行，并遵守当地法规。

8. 肿瘤可能来自皮肤，淋巴结或其他器官。肿瘤的位置可能对结果有影响。例如，皮肤可能被微生物污染，而淋巴结转移可能包含更多无关的T细胞，而来自不同器官的肿瘤物质可能包含其他细胞，例如成纤维细胞，可能在培养中占优。

   一个人可以使用大型切除的肿瘤或小型活检。但是，使用较少的材料，当然存在扩增所需的时间较长的风险，这将降低TIL产品的质量。

   一些研究小组使用酶消化或肿瘤的机械解离产生单细胞悬液，用作TIL增生的起始材料。这种方法当然也可以和肿瘤小片段一样铺板。但是，这确实使监控变得更加困难，例如，更难确定何时应拆分孔，并且漏掉微生物污染的风险也更大。

9. 手术切除的肿瘤材料可能从一开始就被患者的共生或病原微生物污染，或者通过手术程序被污染。为了限制污染的风险，如上所述，可以在运输和培养设置时使用含有抗生素的培养基，以根除任何污染细菌。但是，在整个培养过程中使用抗生素可能会掩盖阴燃感染，因此建议避免全程使用。

   解剖出实际的肿瘤材料也将限制微生物污染的风险。尤其应小心清除皮肤成分。此外，如果收到多个肿瘤样本，则应尽可能将其分开处理。但是，最重要的是要定期对每个孔进行仔细监控，并在早期阶段分别处理怀疑受到污染的孔。请注意，某些感染只会在显微镜下可见，并且可能会非常缓慢地生长。

10. 第一步从肿瘤片段的哪里扩增出TIL是灵活。这是必要的，因为患者之间接收的肿瘤材料的量会有所不同。此外，在某些情况下，TIL的生长可能很慢，这可能是由于肿瘤中存在的TIL数量少或肿瘤内的耗竭或抑制机制损害了TIL的缘故。由于输注的细胞数量与治疗效果之间存在如此明确的联系，因此很容易将细胞培养更长的时间，以便能够在REP中启动更多的G-Rex 100 M烧瓶。但是，培养时间过长可能会产生耗竭和/或终末分化的细胞，因此应优先培养细胞不超过3周。因此，平衡细胞数和培养时间是TIL扩增方法的困难之一，而这只能通过众人皆知的观察TIL培养状况来解决。通过仔细监控孔，在需要时进行拆分，并每隔2至3天定期更新培养基（即使它看起来不用更新），可以将培养时间减至最少。

    通常可以通过体外分析肿瘤细胞的识别功能，对含TIL的孔进行功能筛。但是，任何功能测试的确会增加扩增所需的时间，并且肿瘤细胞必须可用于测试。因此，大多数使用未经筛选的TIL来启动REP流程。

11. 除了TIL的增长缓慢之外，有时后勤问题也可能意味着REP启动延迟。然后，可以选择冻存扩增的TIL，并在开始REP之前的1-2天解冻。但是，冻存确实会对TIL产生负面影响，这也必须权衡到决策中。如果延迟少于一周，冻存可能是一个更差的选择。还可以选择冻存最终产品，但建议尽可能避免冷冻，为患者提供新鲜的细胞产品。

     

Reference

Wickström S., Lövgren T. (2019) Expansion ofTumor-Infiltrating Lymphocytes from Melanoma Tumors. In: Pico de Coaña Y. (eds)Immune Checkpoint Blockade. Methods in Molecular Biology, vol 1913. HumanaPress, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8979-9_7

 

G-Rex淋巴细胞培养专家介绍：

G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶是美国Wilson Wolf Manufacturing(WWM)公司专利认证产品，其一直致力于通过简化过继性免疫治疗的细胞培养步骤，来促进癌症和其他疾病治疗。

 

WWM的G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶是对传统细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养袋的开创性取代选择，克服了免疫细胞治疗（如CAR-T细胞）大规模应用的细胞培养障碍。

 

【G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶产品特点】
北京泽平代理的G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶为新型底透气培养瓶，专为悬浮细胞培养设计，氧气从底部透气膜渗透进入培养体系，细胞自然沉降至培养瓶底部，葡萄糖等营养物质自然对流至细胞，乳酸等代谢废物对流至上层，被大量培养基稀释。

 

G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶独特的结构，相对传统细胞培养瓶、细胞培养板、细胞培养袋，更利于细胞生长：
1、为细胞培养提供更好的氧气交换——G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶独特的气体交换膜为细胞提供均匀的透气膜平面，G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶独特的膜支撑结构使膜保持在水平位置；
2、为细胞培养提供更大来源的养分——G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶使用时培养基的液面很高，远超过普通培养瓶0.3cm或者培养袋1cm的限度；
3、为细胞培养提供良好的流通环境——G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶中细胞与氧气直接交换，二氧化碳直接排出不会影响细胞培养环境；同时，G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶培养基中的溶质通过自然对流可自由移动至细胞，不需要复杂的混合或灌注仪器。

 

【G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶产品优势】
1、节省培养基：使用G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶至少节省50%培养基；
2、节省耗材：最优培养条件下，只需使用1个G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶就能收获满足需求的细胞产品；
3、减少移液操作：简单的一次性加液操作，无需补液；
4、节省培养空间：一层培养箱可放16个G-Rex100细胞培养瓶；
5、收获细胞所需离心瓶少：最多可将90%培养基移除，相当于500mL培养基最终仅需使用1-2个50mL离心管即可完全收集。

 

【G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶产品应用】
【应用一】封闭式培养系统——符合GMP要求的CAR-T细胞培养装置

 

1、一次性加入培养基，培养10天，细胞扩增100倍，不需要反复换液和操作细胞；
2、静置培养，普通的培养箱即可进行；
3、培养瓶与仪器配合，以半自动方式进行细胞回收；
4、生产CAR-T细胞与传统细胞培养方法相比，表达CD62L和CD25的比例更高，抗肿瘤活性更强；
5、封闭系统，满足GMP生产要求。

 

G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶相关产品
1、细胞培养瓶
型号：G-Rex100M CS
货号：81100S-MCS
容积：1000mL
细胞培养面积：100cm2
预期细胞数量：2E9-4E9

 

型号：G-Rex500M CS
货号：85500S-MCS
容积：5000mL
细胞培养面积：500cm2
预期细胞数量：10E9-20E9

 

2、封闭系统的配套仪器，细胞回收时直接去除90%的细胞培养基
型号：GatheRex
货号：80000E

 

【应用二】开放式培养瓶——用于CAR-T细胞优化培养条件及小规模扩增

 

G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶已证实在如下细胞培养中非常有效：
1、T细胞培养（抗原特异T细胞、CAR-T细胞、EBV-CLT、TIL、NK、Treg、HSC、LCL、K562等的研究和临床生产）；
2、单克隆抗体和重组抗体生产（杂交瘤、CHO、293等）；
3、胰岛培养（多至4000 IE/cm2）。

 

G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶相关产品：
型号：G-Rex 24well
货号：80192M
容积：8mL
细胞培养面积：2cm2
预期细胞数量：2E7-8E7

 

型号：G-Rex 6well
货号：80240M
容积：35mL
细胞培养面积：10cm2
预期细胞数量：E8-4E8

 

型号：G-Rex 10
货号：80040S
容积：40mL
细胞培养面积：10cm2
预期细胞数量：E8-4E8

 

型号：G-Rex 10M
货号：80110S
容积：100mL
细胞培养面积：10cm2
预期细胞数量：E8-4E8

 

型号：G-Rex 100
货号：80500S
容积：400mL
细胞培养面积：100cm2
预期细胞数量：2E9-4E9

 

型号：G-Rex 100M
货号：81100S
容积：1000mL
细胞培养面积：100cm2
预期细胞数量：2E9-4E9

 

型号：G-Rex 500M
货号：85500S
容积：5000mL
细胞培养面积：500cm2
预期细胞数量：E10-2E10

 

【G-Rex中国独家代理——北京泽平】
北京泽平为WWM中国地区独家代理商，长期销售WWM旗下G-Rex悬浮细胞透气培养瓶，具有专业的销售人员和技术支持团队，销售区域覆盖全国，多年来、凭借优异的服务在广大客户中树立了良好的口碑。更多G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶产品，微信搜索“泽平科技”公众号 欢迎咨询G-Rex细胞培养技术解决方案。

标签：Rex,扩增,细胞培养,培养基,浸润,细胞,TIL,方法学
来源： https://blog.csdn.net/Bio12345/article/details/111505312

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