标签：CAZ 耐碳 菌株 基因 框架图 KP AVI CR IF5
期刊：《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》
影响因子：5.239
派森诺与福建医科大学附属协和医院李彬老师课题组合作，在微生物基因组领域的《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》发表新研究成果！本研究针对头孢他啶/阿维巴坦（CAZ/AVI）耐药和敏感的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌进行研究，利用基因组和分子遗传学方法鉴定和验证了产生CAZ/AVI耐药性的原因。
研究背景
耐碳青霉烯肠杆菌科（CRE）的出现和流行引起了广泛关注，其中碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CR-KP）是世界上非常常见的。CR-KP可导致多种感染，如肺炎、血液感染和尿路感染，导致了高发病率和死亡率。多粘菌素、替加环素、氨基糖苷类和磷霉素这些抗生素因为有效性和安全性的限制，致使CR-KP感染的患者几乎没有有效的治疗选择。
头孢他啶/阿维巴坦（CAZ/AVI）是头孢他啶和β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦的新组合，具有抗A、C类和一些D类碳青霉烯酶的活性，是目前治疗肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的一种有价值的替代策略。但CAZ/AVI对B类碳青霉烯酶没有活性，如NDM。到目前为止，全球共检测到31个突变体，在这些突变体中NDM-5于2011年在英国的大肠杆菌中被首次发现，并因其迅速传播而引起了全世界的关注。此外，从人类、动物和医院环境的污水中也都发现产生NDM-5肠杆菌菌株，与其他突变体一样，NDM-5可导致CAZ/AVI耐药性。许多研究发现在CAZ/AVI治疗过程中发生抗性，例如blaKPC突变、基因拷贝数增加和基因过表达等，但是在CAZ/AVI治疗过程中获得NDM基因的病例尚未见报道。在本研究中，报道了治疗KPC-2肺炎克雷伯菌的过程中，由于NDM基因而导致CAZ/AVI耐药的出现，并利用基因组和分子遗传学方法鉴定和验证了产生CAZ/AVI耐药性的原因。
研究材料与方法
实验材料：
福建医科大学协和医院分离到的耐CAZ/AVI和CAZ/AVI敏感的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌。
测序平台：
Illumina NovaSeq
分析内容：
细菌框架图测序、接合实验和质粒稳定性实验、药敏实验、基因克隆和qPCR实验等。
研究结果
病例报告
在一次交通事故后，一名67岁男子因肺部感染住进ICU，支气管镜下痰培养后开始用替加环素和多粘菌素治疗产生了CR-KP菌株。然而，经支气管镜检查痰培养的菌株在治疗16天后仍然为CP-KP（KP135194）阳性，对CAZ/AVI敏感，对碳青霉烯类抗生素耐药。对患者进行CAZ/AVI治疗11d，在结束治疗的7d后检测显示KP135194再次呈现阳性，并且对CAZ/AVI和碳青霉烯类抗生素均耐药。另外，在KP135194和KP137060之间未分离到其他CR-KP菌株。在入院第19d、21d、37d和42d，在支气管镜检查后痰培养中均发现了嗜麦芽窄食单胞菌，患者随后出院并转往另一家医院。微生物学细节、时间表和使用的抗生素治疗如图1所示。
图1 CR-KP感染和治疗的时程分析
碳青霉烯类基因克隆和药敏实验
ERIC-PCR分析表明，两株CR-KP分离株具有克隆性关系。KP137060菌株对CAZ/AVI和TGC的MIC值均高与KP135194菌株，MEM、ETP和IMP的MIC相同。两种CP-KPs的药敏图谱如表1所示。克隆实验在两个分离株中都检测到blaKPC-2基因，在菌株KP137060中检测到了blaNDM-5基因。
表1 药敏实验结果
blaKPC-2,ompK35和ompK37基因的突变和表达研究
PCR扩增和一代测序结果表明，在两株CR-KP分离株中均未发现blaKPC-2基因突变 。使用Resfinder检测ompK35和ompK37也未发现突变，同时ompK36在两株分离株中并未检测到。而blaKPC-2、ompK35和ompK37在两个分离株的表达差异无统计学差异。
表2 两株CR-KP菌株的遗传特性及来源
接合实验、质粒稳定性检测和成本评估实验
在研究中发现blaNDM-5基因以1.14x10-4的接合频率成功地转入大肠杆菌J53，而blaKPC-2则失败了，但在PCR检测中证实了blaKPC-2和blaNDM-5的存在。受体细胞和接合子的药敏试验结果如表1所示。质粒稳定性试验表明，携带质粒blaKPC-2和blaNDM-5的质粒在CR-KP中仍能稳定存在150代，而两株CR-KP菌株的生长没有显著差异。体外生长竞争实验结果表明，其相对适宜成本为1.01。
全基因组测序和分析
MLST分析发现这两株CR-KP分离株菌株ST11型，含有β-内酰胺酶基因。全基因组分析表明，KP135194和KP137060菌株高度同源，ANI值为99.99%。核心基因组SNPs分析结果表明，两个菌株的核心基因组中存在23个非同义SNPs。在本研究中，KP137060菌株含有blaNDM-5基因。表2中还检测到其他抗性基因，如rmtB、foA、catA2、sul2、tet(A)和dfrA14基因；毒力基因（rmpA和rmpA2）与超强毒力K相关的荚膜类型（K1和K2）基因相关的hvKp并未检测到。
图2：质粒图谱
与菌株KP135194相比，KP135194菌株多了一个IncX3质粒。此外，全基因组测序结果表明blaKPC-2(IncFII/IncR)和blaNDM-5(IncX3)分别位于两个不同的质粒上，blaKPC-2和blaNDM-5质粒的全核苷酸序列及质粒大小如图2所示。关于blaKPC-2基因的遗传环境，blaKPC-2基因上游有Tn1331元件，下游有一个可能的ISKpn6类似元件，紧随其后的是korC基因，一个编码假定蛋白基因和一个klcA基因。对于blaNDM-5基因则定位于IS26元件、编码双精氨酸转位途径信号序列域蛋白的基因、编码假定蛋白的基因和编码磷酸化氨基硅酸异构酶基因trpF之间。此外，还有一个IS5元件位于blaNDM-5下游。
研究结论
本研究发现，产KPC-2肺炎克雷伯菌在治疗过程中产生了携带blaNDM-5的质粒，导致对CAZ/AVI耐药性。同时携带NDM-5的质粒具有可转移性，接合频率为1.14x10-4。此外，在携带blaNDM-5的质粒上没有发现明显的适合性成本。因此，通过细菌培养和药敏试验仔细监测耐药性的发展是重要的，并且需要持续监测以避免CAZ/AVI的CR-KP传播。
标签：CAZ,耐碳,菌株,基因,框架图,KP,AVI,CR,IF5 来源： https://blog.csdn.net/muhamuha2020/article/details/121541828
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